凱氏定氮法測定人血白蛋白中蛋白質含量的不確定度評價

更新時間：2011-01-20 點擊次數：5268

蛋白質含量是人血白蛋白質量評價的重要指標。不確定度是與測量結果相關聯的參數,表征合理地賦予被測量值的分散性。本文對凱氏定氮法測定人血白蛋白中蛋白質含量的不確定度來源和大小進行分析和評價,并初步探討在運用該方法的過程中應注意的問題,旨在為人血白蛋白以及食品（尤其是乳制品）中的蛋白質含量測定提供一定參考。推薦使用儀器：KDN-08A，蛋白質測定儀（http://www.dsddy.cn/）。

　實驗材料及條件

1.1　儀器及試藥

儀器:自動定氮儀（ Gerhardt Vapodest 30 DigestSystem） ;玻璃儀器（ 1、2、10 mL 移液管; 20、100 mL容量瓶; 25 mL酸式滴定管） , 20 ℃下校準。試藥:人血白蛋白（貴陽黔峰生物制品有限公司生產, 批號為20070830, 規格為20% , 10 g） ;01005 mol·L - 1硫酸滴定液（本所化學室標定） ;10%鎢酸鈉溶液; 0133 mol·L - 1硫酸溶液; 2%硼酸溶液; 40%氫氧化鈉溶液;甲基紅-溴甲酚綠混合指示液; 98%硫酸;無水硫酸鈉;硫酸銅。

1.2　實驗室環境

溫度變化范圍: （20 ±4） ℃。

　方法

2.1　試驗過程

按照中國藥典2005年版三部的規定,測定人血白蛋白中的蛋白質含量,過程見圖1。

2.2　建立數學模型

人血白蛋白中蛋白質含量W 的計算公式為:

rep為總重復性因子。

以y表示W , xi表示第i個影響參數,得y的合成標準不確定度為:

其中ci為靈敏系數,記為偏導5y /5x; u （ y, xi ）為由xi不確定度引起的y的不確定度。

　不確定度的來源及分析

3.1　不確定度的來源

從人血白蛋白中蛋白質含量測定流程圖來看,凱氏定氮法測定蛋白含量的不確定度主要來源于9個方面: 1）試驗重復性; 2）標定硫酸滴定液濃度; 3）稀釋硫酸滴定液; 4）測定總氮稀釋樣品; 5）滴定總氮吸取樣品; 6）滴定總氮實際消耗硫酸滴定液的體積; 7）測定非蛋白氮稀釋樣品; 8）滴定非蛋白氮吸取樣品; 9）滴定非蛋白氮實際消耗硫酸滴定液的體積。

3.2　不確定度u （ xi ）的量化分析

3.2.1　由試驗重復性引入的標準不確定度u （ rep）按藥典標準對人血白蛋白樣品平行測定6次,結果見表1。

　測量的標準不確定度: u （ rep） = s /6015 = 01002 4

3.2.2　標定硫酸滴定液濃度引入的不確定度u （CD ）由標定01005 mol·L - 1硫酸滴定液所引入的不確定度u （CD ） = 111 ×10- 4 mol·L - 1。

3.2.3　稀釋硫酸滴定液引入的不確定度u （VD1 / VD2 ）

試驗中需將01052 32 mol·L - 1硫酸滴定液定量稀釋成01005 232 mol·L - 1 ,根據《常用玻璃量器檢定規程》查得,*1010 mL移液管和*100 mL容量瓶的允許偏差分別為±0102和±0110 mL ,近似于三角形分布,換算成校準不確定度分別為: 0102 /6015 = 01008 2 mL, 0110 /6015 = 01041 mL。該容量瓶和移液管均在20 ℃校準。本實驗室溫度變化范圍為（20 ±4） ℃,近似于矩形分布。水的膨脹系數為211 ×10- 4。換算成溫度不確定度分別為:

3.2.4　測定總氮稀釋樣品（VT1 / VT2 ）引入的不確定度u （VT1 / VT2 ）

由《常用玻璃量器檢定規程》可知,*110 mL移液管和A 級20 mL 容量瓶的允許偏差分別為±0.007和±0.02 mL,近似于三角形分布,換算成校準不確定度分別為:

3.2.5　滴定總氮吸取樣品（VT3 ）引入的不確定度u （VT3 ）與“31214”項相同,*110 mL移液管的的校準不確定度為01002 9 mL,溫度不確定度為01000 48 mL。

由上述不確定度分量合成得:

u （VT3 ） = （01002 92 + 01000 482 ） 015 = 01002 9 mL

3.2.6 　滴定總氮實際消耗硫酸滴定液的體積（VT4 - V0 ）引入的不確定度u （VT4 - V0 ）1）肉眼判斷終點所引入的不確定度已包含在測量重復性引入的標準不確定度u （ rep ）中,此處不再考慮; 2）滴定管引入的標準不確定度:由《常用玻璃量器檢定規程》可知, 2510 mL的*滴定管其zui大容量的允許偏差為±0104 mL ,近似于三角形分布,換算成校準不確度為:

3.2.7　測定非蛋白氮稀釋樣品（VN1 / VN2 ）引入的不確定度u （VN1 / VN2 ）由《常用玻璃量器檢定規程》可知,*210 mL移液管和A 級20 mL 容量瓶的允許偏差分別為±01010和±0102 mL.,近似于三角形分布.,換算成校準不確定度分別為:

3.2.8　滴定非蛋白氮吸取樣品（VN3 ）引入的不確定度u （VN3 ）

u （VN3 ）即由510 mL 移液管引入的不確定度。由《常用玻璃量器檢定規程》可知, *510 mL 移液管的允許偏差為±01015 mL. ,近似于三角形分布.,換算成校準不確定度為:

01015 /6015 = 01006 2 mL

溫度不確定度為:

510 ×211 ×10 - 4 ×4 /3015 = 01002 4 mL

由上述不確定度分量合成得:

u （VN3 ） = （01006 22 + 01002 42 ） 015 = 01006 6 mL

3.2.9　滴定非蛋白氮實際消耗硫酸滴定液的體積（VN4 - V0 ）引入的不確定度u （VN4 - V0 ）

1）肉眼判斷終點所引入的不確定度已被包含在測量重復性引入的標準不確定度u （ rep ）中,在此處不再考慮。2）滴定管引入的標準不確定度:查標準得2510 mL的*滴定管其zui大容量的允許偏差為±0104 mL ,近似于三角形分布,換算成校準不確度為:

3.3　不確定分量及各分量分析

在不確定度表達式中,假如y （ x1 , x2 , ?, xi ）對xi是線性或與xi相比其u （ xi ）較小,偏導（ 5y /5x）可近似為:5y /5x≈ { y [ xi + u （ xi ） ] - y （ xi ） } /u （ xi ）將u （ xi ）計入,獲得因xi不確定度引起的y的不確定度u （ y, xi ） ,即:

u （ y, xi ）≈ y{ x1 , x2 ?[ xi + u （xi ） ]?xn } - y （x1 , x2 , ?, xi , ?, xn ）

根據上式,由各不確定分量u （xi ）進行計算可得到對應的u （y, xi ） ,結果見表2。

314　合成標準不確定度及擴展不確定度的計算根據表2結果,可得合成標準不確定度（ uc ）為:

擴展不確定度（U）的計算公式為: U = k·uc置信因子（ k）取2,即置信概率為95% ,可得:

U = 0.62% ×2 = 1.2%故人血白蛋白中蛋白質含量W （% ）可表示為（104.7 ±1.2） %。

　討論

根據小分量不確定度不足zui大分量不確定度的1 /3時,小分量不確定度可以忽略不計的原則,由以上的評定結果可看出,本方法測定結果的不確度主要來源于6個分量:測定總氮稀釋樣品的不確定度u （VT1 / VT2 ）、滴定總氮吸取樣品的不確定度u （VT3 ）、測量重復性u （ rep ）、標定硫酸滴定液濃度的不確定度u （CD ）、滴定總氮實際消耗硫酸滴定液的不確定度u （VT4 - V0 ）、稀釋硫酸滴定液的不確定度u （VD1 / VD2 ）。

在試驗中使用的玻璃儀器均為*,因此不能通過提高儀器的精密度改善結果,但可采取下述2個措施降低本方法的不確定度。1）使用較大規格的移液管。u （VT1 / VT2 ）與u （VT3 ）較大的原因是110 mL移液管引入的不確定度明顯大于較大規格的移液管。故在使用本方法測定樣品時,在樣品量允許的前提下,通過重新設計試驗步驟,在吸取樣品時選用較大規格的移液管,將能顯著降低u （VT1 / VT2 ）與u （VT3 ）。2）使用合適的自動化儀器進行樣品消化及滴定,同時規范試驗操作,嚴格控制試驗條件,將能有效控制試驗過程中產生的隨機誤差,從而降低u （ rep）。

本文來自：http://www.dsddy.cn/

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